إنتاج وتوصيف بيوكيميائي لإنزيم لاكاز فطر المحار NRC 620 وتقييم كفاءته في تصفية عصير التفاح.

بعد 25 يومًا من الحضانة الثابتة عند درجة حرارة 28 درجة مئوية، أظهر إنزيم اللاكاز المستخلص من فطر المحار (Pleurotus ostreatus) NRC620 أعلى نشاط له في وسط الاستنبات الفطري. وكانت قيم الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة المثلى لهذا الإنزيم 3.0 و70 درجة مئوية على التوالي. بعد ساعتين من الحضانة عند درجتي حرارة 40 و50 درجة مئوية، احتفظ الإنزيم بنشاطه بنسبة 68.33% و59.61% على التوالي. وبعد ساعتين من الحضانة في محلول منظم من سترات الفوسفات (الأس الهيدروجيني 7.0)، بقي نشاط الإنزيم عند 100%. أدت إضافة 10 ملي مولار من كبريتات المغنيسيوم (MgSO₄) وكبريتات النحاس (CuSO₄) إلى زيادة نشاط الإنزيم بنسبة 21% و35% تقريبًا على التوالي، بينما أدت إضافة كلوريد الصوديوم (NaCl) وكلوريد المنغنيز (MnCl₂) وكلوريد البوتاسيوم (KCl) وكلوريد الكالسيوم (CaCl₂) إلى تثبيط نشاط الإنزيم. باستخدام ABTS كركيزة، بلغت المعاملات الحركية (Km وVmax) لإنزيم اللاكاز من فطر المحار *Pleurotus ostreatus* NRC 620، 1.99 ملي مولار و16217 ميكرومول/دقيقة/لتر على التوالي. أدى المعالجة الإنزيمية لعينات عصير التفاح إلى انخفاض ملحوظ في كل من الرقم الهيدروجيني واللزوجة، وتزامن هذا الانخفاض مع زيادة مدة التخزين. نتج عن المعالجة باللاكاز انخفاض طفيف في إجمالي محتوى الفينولات في عصير التفاح، ولكن لم يُلاحظ أي انخفاض في النشاط المضاد للأكسدة.
في السنوات الأخيرة، ركز الباحثون على تطبيق التكنولوجيا الحيوية الخضراء في صناعة الأغذية. يُعدّ إنزيم اللاكاز من أكثر الإنزيمات فائدةً في هذه الصناعة، حيث يُستخدم في مجالاتٍ مثل معالجة العصائر، والخبز، وتثبيت النبيذ، وتحسين الخصائص الحسية للمنتجات الغذائية.¹تفرز العديد من النباتات الراقية والكائنات الدقيقة إنزيم اللاكاز.²ويمكن للفطريات مثل الفطريات الناقصة والفطريات الزقية والفطريات البازيدية أن تنتج أيضًا إنزيم اللاكاز.³إنزيم اللاكاز (EC 1.10.3.2) هو أوكسيداز أزرق اللون، يعمل على اختزال الأكسجين الجزيئي إلى ماء باستخدام نظام يتكون من ثلاث ذرات نحاس مختلفة، مما يؤدي إلى أكسدة مركبات فينولية وأمينات عطرية متنوعة. يُعدّ كلٌّ من التسمير الإنزيمي وغير الإنزيمي من المشكلات الحرجة أثناء إنتاج عصائر الفاكهة والخضراوات.⁴وبما أن هذه المواد تؤثر سلباً على لون ونكهة ورائحة العصير، فيجب إزالتها.⁵
من بين جميع الفواكه، يُعد التفاح الأكثر استهلاكاً على مستوى العالم وفي الاتحاد الأوروبي. في عام 2019، احتل إنتاج التفاح المرتبة الثالثة عالمياً، متجاوزاً 87 مليون طن.⁶يحتوي التفاح على العديد من المركبات الفينولية، بما في ذلك الفلافونويدات والأحماض الفينولية مثل حمض الكافيين وحمض الكلوروجينيك.⁷لأن عصير التفاح عادة ما يستهلك في صورته الصافية، فإن ما يقرب من 50٪ إلى 90٪ من المكونات الفينولية تفقد أثناء عملية الترشيح.⁸يميل المستهلكون اليوم إلى اختيار المنتجات قليلة المعالجة، مثل عصير التفاح المعكر ذي المحتوى العالي من البوليفينولات. ومع ذلك، ونظرًا لمحتواه العالي من الفينولات، فإن هذا النوع من عصير التفاح معرض بشكل خاص لتغير اللون واسوداده.⁹تُستخدم تقنيات مختلفة، بما في ذلك طرق المعالجة الحرارية مثل البسترة عند 60-90 درجة مئوية، لتقليل أو منع اسمرار عصير التفاح.¹⁰ومع ذلك، وفقا لبحث أجرته سوسيدا غالفيز¹¹قد تؤدي المعالجة الحرارية إلى تدمير المواد الكيميائية المتطايرة والتأثير على الخصائص الحسية لعصير التفاح. تشمل البدائل لطرق المعالجة الحرارية ثاني أكسيد الكربون فوق الحرج، والأشعة فوق البنفسجية، والموجات فوق الصوتية، والضغط الهيدروستاتيكي العالي، أو التجنيس عالي الضغط.¹²تعتمد كفاءة هذه التقنيات وإنتاجية عصائر الفاكهة المناسبة على المعايير المستخدمة وخصائص المنتج. ويُحدّ من انتشار استخدامها ارتفاع تكلفتها، وآثارها السلبية على جودة بعض المنتجات الغذائية، أو عدم كفاية تعطيل الإنزيمات.^13،14
يمكن استخدام إنزيم اللاكاز لتثبيت وتصفية عصير الفاكهة.¹⁵جوكمن وآخرون¹⁶يُوصى باستخدام إنزيم اللاكاز لتصفية عصائر الفاكهة، لأنه يُزيل المركبات الفينولية بفعالية عن طريق تحويلها إلى بوليمرات أو قليلات الوحدات التي يسهل إزالتها بواسطة أي غشاء ترشيح فائق، مما يسمح لعصير التفاح بالحفاظ على لونه ونقائه لمدة تصل إلى ستة أسابيع عند درجة حرارة 50 درجة مئوية. تم تثبيت إنزيم اللاكاز المُنقّى من *Trichoderma* على حبيبات الألومينا، واستُخدم لإزالة مركبات النكهة غير المرغوبة الناتجة عن التلوث الميكروبي لعصير التفاح بشكل انتقائي.¹⁷
تشكل الإسترات والألدهيدات ما يقرب من 80-90% من المكونات المتطايرة في عصير التفاح، والتي تضفي رائحة فريدة على العصير.¹⁸تم تثبيت إنزيم اللاكاز من *Trametes versicolor* على دعامة غير مكلفة مصنوعة من ألياف طبيعية من قشور جوز الهند الصغيرة لتصفية عصير التفاح.¹⁹وقد بحثت الدراسات السابقة في تثبيت عصير التفاح (اللون والتعكر) باستخدام طرق خالية من الإنزيمات أو طرق التثبيت، أو بالاشتراك مع الترشيح الفائق.^5.19مع ذلك، لا يزال تأثير إنزيمات اللاكيز الفطرية على الخصائص الفيزيائية والكيميائية لعصير التفاح أثناء التخزين غير واضح. لذا، هدفت هذه الدراسة إلى التحقق تجريبيًا من التغيرات في الخصائص الفيزيائية والكيميائية، ومحتوى المركبات الفينولية، ونشاط مضادات الأكسدة في عصير التفاح بعد معالجته بإنزيمات اللاكيز الفطرية وتخزينه مبردًا لمدة أسبوعين. تتميز إنزيمات اللاكيز بقدرتها على أكسدة المركبات الفينولية، مما يجعلها واعدة للاستخدام في العديد من العمليات الصناعية، بما في ذلك تصفية العصائر. فحصت هذه الدراسة إنزيمات اللاكيز المستخلصة من فطر المحار (Pleurotus ostreatus NRC 620)، مع التركيز على الظروف المثالية لنشاطها وفعاليتها في تصفية العصائر. في حين أن الأبحاث حول فطر المحار (P. ostreatus NRC 620) لا تزال محدودة، فقد تناولت دراسات سابقة إنزيمات من مصادر فطرية مختلفة، مثل Trametes versicolor و Ganoderma lucidum. هدفت هذه الدراسة إلى تقييم التطبيق المحتمل لهذا الإنزيم في صناعة الأغذية وتسليط الضوء على خصائصه الفريدة، ولا سيما درجة الحموضة ودرجة الحرارة المثالية له.
تم شراء 2,2′-أزوكسيبيس(3-إيثيل بنزوثيازولين-6-حمض السلفونيك) (ABTS) من شركة سيجما-ألدريتش (كندا). جميع الكواشف الأخرى كانت من الدرجة التحليلية.
حصل مركز تجميع المزارع الميكروبية التابع للمركز القومي للبحوث على سلالة فطر المحار المعروفة NRC620. بعد إعادة الاستزراع، حُفظت هذه السلالة على أنابيب أجار البطاطا والدكستروز عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. وكانت طريقة تحضير اللقاح كما يلي: تم تلقيح غزل فطري مكتمل النمو عمره 10 أيام على أطباق أجار البطاطا والدكستروز وحُضن عند درجة حرارة 28 درجة مئوية. بعد 10 أيام، أُزيلت ثلاث قطع من الغزل الفطري بقطر 12 مم من وسط الأجار باستخدام مثقب معدني معقم، ووُضعت في قوارير إرلنماير سعة 250 مل مزودة بسدادات قطنية تحتوي على 50 مل من وسط الاستزراع المعقم (درجة الحموضة 5.0، كما وصفها عثمان وآخرون سابقًا).²⁰حُضنت المزارع عند درجة حرارة 28 درجة مئوية لمدة 18 يومًا. ثم رُشحت المزارع عبر ورق ترشيح واتمان رقم 1، واستُخدم الراشح الناتج كمصدر للإنزيم.
تم تحديد نشاط إنزيم اللاكاز باستخدام ABTS كركيزة. احتوى مزيج التفاعل (2 مل) على 500 ميكرولتر من ABTS بتركيز 0.3 ملي مولار (مذاب في محلول منظم من سترات الصوديوم بتركيز 0.1 مولار، ودرجة حموضة 4.5) والكمية المطلوبة من عينة الإنزيم المخففة بالماء المقطر.^21,22بالنظر إلى أن إنزيم اللاكاز يمكنه أكسدة ABTS في درجة حرارة الغرفة (28 درجة مئوية ± 2)، فقد تم تحديد أكسدة ABTS عن طريق قياس الزيادة في الامتصاص عند 420 نانومتر (ε).₄₂₀= 36000 سم^-1 M ^-1تم قياس تركيز البروتين باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية Agilent Carry-100. تطلّب الأمر وحدة واحدة من نشاط إنزيم اللاكاز لأكسدة 1 ميكرومول من ABTS في الدقيقة. وتم تحديد تركيز البروتين بطريقة برادفورد باستخدام ألبومين مصل البقر كعنصر تحكم داخلي.^23,24
بعد الحصول على الإنزيم من سلالة فطر المحار NRC 620، تم قياس نشاطه على فترات زراعة مختلفة لمدة 25 يومًا في ظل ظروف ثابتة عند 28 درجة مئوية.
لدراسة تأثير درجة الحرارة على نشاط إنزيم اللاكاز، أُجريت تجارب في نطاق درجات حرارة يتراوح بين 20 و90 درجة مئوية. قبل إضافة الإنزيم وبدء التفاعل، خُلط المحلول المنظم (0.1 مولار سترات الصوديوم، الرقم الهيدروجيني 4.5) مع الركيزة (ABTS) وحُضن المزيج لمدة 5 دقائق عند درجات حرارة مختلفة. قُيِّمَ الثبات الحراري للإنزيم عن طريق تحضينه في محلول منظم من فوسفات الصوديوم بتركيز 0.05 مولار (الرقم الهيدروجيني 7.0) عند درجات حرارة 40 و50 و60 و70 درجة مئوية لمدة ساعتين لكل منها. ثم قُيِّمَ النشاط المتبقي باستخدام ركيزة ABTS.
تم تقييم تأثير الرقم الهيدروجيني على نشاط إنزيم اللاكاز باستخدام ABTS كركيزة في محاليل منظمة من سترات-فوسفات بتركيز 0.1 مولار، ضمن نطاق رقم هيدروجيني يتراوح بين 2.5 و7.0. حُضنت محاليل الإنزيم عند درجة حرارة 40 درجة مئوية لمدة ساعتين في محاليل منظمة من سترات وتريس بتركيز 0.1 مولار (عند أرقام هيدروجينية 3، 4، 6، و7) لتقييم استقرار الرقم الهيدروجيني. حُسب النشاط المتبقي باستخدام ABTS كركيزة بعد التحضين.
حُضِن إنزيم اللاكاز لمدة 10 دقائق في محلول منظم من فوسفات الصوديوم (0.05 مولار، الرقم الهيدروجيني 7.0) يحتوي على أيونات فلزية مختلفة (Mg2+، Cu2+، Co2+، Ca2+، Zn2+، K+، Na+، وMn2+) بتراكيز 2.5 ملي مولار و10 ملي مولار على التوالي. ثم أُضيف الركيزة (ABTS) لبدء التفاعل، وقُيِّم النشاط النسبي.
تم قياس أكسدة ABTS بواسطة إنزيم اللاكاز بتراكيز مختلفة (0.025-3 ملي مولار) عند درجة حموضة 4.5 لتحديد المعاملات الحركية (Vmax و Km).^{الثوابت}تم حساب معادلات ميكايليس-مينتين باستخدام مخطط لاينويفر-بيرك، الذي يرسم مقلوب معدل التفاعل كدالة لتركيز المادة المتفاعلة. وتم حساب الثوابت الحركية من مخطط لاينويفر-بيرك باستخدام برنامج GraphPad Prism الإصدار 6.01.
بعد غسل التفاح جيداً بماء الصنبور، قُطّع إلى نصفين وعُصر باستخدام عصارة تفاح براون MP80 أوتوماتيكية بالكامل (صنع في ألمانيا). رُشّح العصير عبر أربع طبقات من الشاش. لم تُضَف أي إنزيمات إلى المجموعة الضابطة، بينما أُضيف 2.0% من إنزيم اللاكاز (التركيز الأكثر فعالية الذي تم اختباره) إلى عصير التفاح المُحضّر حديثاً، والذي حُفظ بعد ذلك في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين.
تم تحديد الحموضة القابلة للمعايرة (TA) ودرجة الحموضة (pH) وفقًا لطريقة بولتون وآخرون.²⁷تم قياس درجة حموضة كل عينة باستخدام جهاز قياس رقمي (جهاز قياس الحموضة JENWAY 3510). حُسبت الحموضة القابلة للمعايرة (TA) بناءً على حمض الماليك باستخدام الصيغة التالية.
حيث V و C هما حجم (مل) وتركيز (0.1 مول/لتر) محلول هيدروكسيد الصوديوم المستخدم في المعايرة، على التوالي. K هو معامل تحويل حمض الماليك، ويساوي 0.067، و W هي كتلة (غ) عصير التفاح.
إجمالي المواد الصلبة الذائبة (^{إجمالي المواد الصلبة الذائبة}تم تحديد محتوى جميع عينات العصير باستخدام مقياس انكسار ضوئي محمول من نوع PAL-1 (شركة ATAGO، طوكيو، اليابان). بعد كل قياس، تم شطف العدسة البصرية بالماء منزوع الأيونات، وتم اختبار كل عينة من عصير التفاح ثلاث مرات. حُسبت قيمة كل عينة عن طريق حساب متوسط ​​القياسات الثلاثة. كما حُسب المتوسط ​​± الانحراف المعياري لكل عينة من عصير التفاح عن طريق حساب متوسط ​​هذه النتائج.
تم تقييم اللزوجة المرنة لعينات عصير التفاح باستخدام مقياس لزوجة دوراني (RV، Rheotest 2، ألمانيا). وُضعت العينة داخل أسطوانة "S2" الخاصة بالمقياس. تم تمثيل اللزوجة الظاهرية بميل منحنى إجهاد القص مقابل معدل القص، والذي حُسب من إجهاد القص والمنحنيات المقابلة عند معدلات قص مختلفة (من 1.00 إلى 437.4 ثانية⁻¹). صيغة حساب اللزوجة الظاهرية هي كما يلي:
حيث η هي اللزوجة الظاهرية (سنتي بواز)، وτ هو إجهاد القص (داين/سم²)، وγ هو معدل القص (ثانية⁻¹)، ويتم حساب (τ) باستخدام قيم عزم الدوران (α) والأسطوانة (Z) باستخدام الصيغة التالية: τ = Z . α.
تم تحديد مؤشر التسمير وفقًا لطريقة ميداف وآخرون²⁹تم طرد عينة من العصير حجمها 10 مل بالطرد المركزي عند قوة 2750 ضعف قوة الجاذبية الأرضية لمدة 10 دقائق. ثم خُلط 5 مل من الراشح مع 5 مل من الإيثانول بتركيز 95%. وقيس امتصاص الخليط عند طول موجي 420 نانومتر باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية من نوع شيمادزو (UV-1601 PC).
تم تحديد إجمالي محتوى الفينول (TPC) باستخدام كاشف فولين-سيوالتو كما هو موضح من قبل بولتون وآخرون.^[27تم إنشاء منحنى قياسي لحمض الغاليك لتركيزات تتراوح من 0 إلى 500 ملغم/لتر (^r²= 0.997). يتم التعبير عن النتائج بمكافئات حمض الغاليك (ملغم GAE/مل).
أضف 125 ميكرولتر من الماء المقطر و2850 ميكرولتر من محلول FRAP إلى 25 ميكرولتر من عصير التفاح، واترك المزيج في الظلام لـ³⁰دقيقة. ثم قم بقياس الامتصاص عند 593 نانومتر باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية من شيمادزو (UV-1601 PC). تم تحضير كاشف FRAP عن طريق خلط 300 ملي مولار من محلول أسيتات منظم (الأس الهيدروجيني 3.6)، و20 ملي مولار من كلوريد الحديد (III)، و10 ملي مولار من 2،4،6-تريس(2-بيريديل)تريازين (TPTZ) (مذاب في 40 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك) بنسبة 10:1:1. تم إنشاء منحنى قياسي باستخدام ترولوكس كمعيار (^R²= 0.999)، ويتم التعبير عن النتائج بوحدة ميكرومول ترولوكس/مل.
تم تحديد النشاط المضاد للأكسدة للعصائر المعالجة وغير المعالجة باستخدام طريقة DPPH لتقييم قدرتها على التخلص من الجذور الحرة DPPH.³¹تم مزج عشرة ميكرولترات من العصير مع 1 مل من محلول DPPH (100 ميكرومولار) في الميثانول. بعد التفاعل في الظلام لمدة 30 دقيقة، تم قياس امتصاص الخليط عند 517 نانومتر باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية من شركة شيمادزو (UV-1601 PC). تم التعبير عن النتائج بوحدات مكافئة للترولوكس (ميكرومولار ترولوكس/مل) بناءً على منحنى معايرة._^R2= 0.990).
أظهرت البيانات المُستخلصة أن أعلى إنتاج لإنزيم اللاكاز لوحظ في فطر المحار NRC 620 بنهاية اليوم الثامن عشر من التخمير، حيث بلغ نشاطه 1302 وحدة/لتر. وقد شكل هذا أساسًا لتحديد مدة التخمير المثلى لإنتاج اللاكاز (الشكل 1). على الرغم من أن إنتاج الإنزيم ازداد مع زيادة مدة التخمير، إلا أن معدل الزيادة لم يكن متناسبًا طرديًا مع مدة التخمير؛ فبعد 21 يومًا، لم يزد نشاط الإنزيم إلا بمقدار 90 وحدة/لتر (ليصل إلى 1390 وحدة/لتر). لذلك، تم اختيار 18 يومًا في نهاية المطاف كمدة تخمير مثلى لتحقيق التوازن بين إنتاجية المنتج والفوائد الاقتصادية لزيادة مدة التخمير.
تأثير وقت الزراعة على إنتاج اللاكاز في Pleurotus ostreatus NRC 620. تم تلقيح ثلاث كتل فطرية (12 مم) في 50 مل من الوسط المعقم ثم تمت زراعتها عند 28 درجة مئوية لفترات زمنية مختلفة.
تماشياً مع الدراسات الأخرى، تشير نتائجنا إلى أن فترة الاستزراع المثالية لتحقيق ذروة إفراز اللاكاز بواسطة الفطريات من المرجح أن تكون بين 7 و 36 يومًا.³²وفقًا لإيزيكي وآخرون.³³أنتجت سلالة *Trametes polyzona* WRF03 أعلى كمية من إنزيم اللاكاز بنهاية اليوم التاسع من التخمر، بنشاط نوعي قدره 1637 وحدة/ملغ بروتين. علاوة على ذلك، ذكر عثمان وآخرون...³⁴أظهرت النتائج أن فطر *Trichoderma harzianum* S7113 يُفرز كمية كبيرة من إنزيم اللاكاز في اليوم الخامس من الزراعة. وبلغ معدل إنتاج اللاكاز ذروته في اليوم الرابع عشر، ثم انخفض تدريجياً.³⁴على الرغم من أن إفراز الإنزيم يمكن أن يحدث أيضًا خلال مرحلة النمو الرئيسية، إلا أنه عادة ما يبلغ ذروته خلال المرحلة المتوسطة ويتم تحفيزه عن طريق استهلاك مصدر للكربون أو النيتروجين.^34،35
على الرغم من أن إنزيم اللاكاز المستخلص من فطر المحار (Pleurotus ostreatus NRC 620) أظهر نشاطًا عاليًا ضمن نطاق واسع من درجات الحرارة يتراوح بين 50 و80 درجة مئوية، مقتربًا من ذروة نشاطه (69-98%)، إلا أن أعلى نشاط له لوحظ عند 70 درجة مئوية (الشكل 2أ). خارج هذا النطاق الحراري، انخفض نشاط الإنزيم عند حوالي 70 درجة مئوية. تشير هذه النتائج إلى أن الإنزيم يكون نشطًا عند درجات الحرارة المرتفعة، على الأرجح لأن ارتفاع درجة الحرارة يزيد من الطاقة الحركية للتفاعل.
تأثير درجة حرارة التفاعل (أ) ودرجة الحموضة (ب) على نشاط إنزيم اللاكاز في فطر المحار (Pleurotus ostreatus) NRC 620. تم ضبط درجات الحرارة من 20 إلى 90 درجة مئوية عن طريق تحضين المزيج مسبقًا عند درجات حرارة مختلفة لمدة 5 دقائق قبل إضافة الإنزيم وبدء التفاعل. تم تقييم تأثير درجة الحموضة على نشاط إنزيم اللاكاز باستخدام ABTS كركيزة في محاليل تحتوي على محلول منظم من سترات الفوسفات بتركيز 0.1 مولار، ضمن نطاق درجة حموضة من 2.5 إلى 7.0.
بحسب إيزيك وآخرون³³درجة الحرارة المثلى لإنزيم اللاكاز في *Trametes polyzona* WRF03 هي 55 درجة مئوية، وهي نفس درجة الحرارة المثلى لإنزيم اللاكاز في *Ganoderma lucidum*.^{لاكاز 36}ومماثلة لدرجة الحرارة المثلى (50 درجة مئوية) لـ *Trametes polyzona* KU-RNW02737^لاكاز . ^Baldrian38ويشير إلى أنه، كما هو الحال بالنسبة لأنظمة الإنزيمات الأخرى التي تحلل اللجنين، فإن نطاق درجة الحرارة المثالي لإنزيم اللاكاز يتراوح بين 50 و 70 درجة مئوية.
أظهرت النتائج أن الإنزيم أظهر أعلى نشاط له عند درجة حموضة 3.0، حيث بلغ نشاطه 94% عند درجة حموضة 3.5. ومع ذلك، ظل نشطًا ضمن نطاق واسع من درجات الحموضة يتراوح بين 2.5 و7.0 (الشكل 2ب). علاوة على ذلك، أظهر نشاطًا أعلى في الظروف الحمضية مقارنةً بالظروف المتعادلة أو القلوية. وظل نشاطه عند 77% على الأقل ضمن نطاق درجات الحموضة من 2.5 إلى 4.5، ولكنه لم يتجاوز 38% تقريبًا عند درجة حموضة 7.0. وكانت درجة الحموضة المثلى لإنزيم اللاكاز من *Trametes polyzona* WRF03 هي 4.533، وهي نفس درجة الحموضة المثلى لإنزيمات اللاكاز من *Trametes polyzona* KU-RNW02737، و*Trichoderma harzanium* 39، و*Pleurotus* sp. 40، و*Trametes hirsuta* 41. ومع ذلك، وفقًا لدراسة تشيرين وآخرون.⁴²الرقم الهيدروجيني الأمثل لإنزيم اللاكاز من *Polymorpha f. sp.* WR710-1 هو 2.2، بينما الرقم الهيدروجيني الأمثل لإنزيم اللاكاز من *Polymorpha f. sp.* IBL-04 هو 5.043. قد يكون ارتباط أيونات الهيدروكسيد (مثبط اللاكاز) بذرات النحاس في إنزيم اللاكاز T2/T3 سببًا لانخفاض نشاط اللاكاز في ظروف الرقم الهيدروجيني المتعادل أو القلوي. قد يؤدي ذلك إلى تعطيل انتقال الإلكترونات الداخلي من مركز T1 إلى مركز T2/T3، وبالتالي^الحدنشاط الإنزيم 23،44
من خلال حضانة الإنزيم عند درجات حرارة مختلفة، تبيّن أن كلاً من مدة الحضانة ودرجة الحرارة يؤثران على استقرار الإنزيم. والجدير بالذكر أن إنزيم اللاكاز المستخلص من *Trametes polyzona* NRC 620 أظهر استقرارًا أعلى عند 40 درجة مئوية و50 درجة مئوية، حيث احتفظ بنسبة 68.33% و59.61% من نشاطه الأولي، على التوالي، بعد 120 دقيقة (الشكل 3أ). في المقابل، وفي ظل الظروف نفسها (40 درجة مئوية و50 درجة مئوية، 120 دقيقة)، احتفظ إنزيم اللاكاز المستخلص من *Trametes polyzona* WRF03 بنسبة 64.38% و42.92% من نشاطه، على التوالي.³³على النقيض من ذلك، أدى زيادة وقت ودرجة حرارة الحضانة إلى انخفاض استقرار إنزيم اللاكاز من *Trametes polyzona* NRC 620؛ فبعد حضانة الإنزيم عند 60 درجة مئوية و70 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، انخفض نشاطه إلى 39.24% و1.72% على التوالي (الشكل 3أ). وتماشياً مع النتائج التجريبية، أظهر إنزيم اللاكاز من *Trametes polyzona* WRF03 استقراراً أعلى عند 40 و50 درجة مئوية طوال عملية المعالجة الحرارية.³³وبالمثل، Lueangjaroenkit et³⁷وشايرين وآخرون⁴²أظهرت دراسة استقرار إنزيمات اللاكاز المستخلصة من سلالتي Trametes polyzona KURNW027 و Trametes polyzona WR710-1 عند درجة حرارة 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. وباعتبارها محفزًا حيويًا مفيدًا يُستخدم في مجالات التقنية الحيوية المختلفة، يُتوقع أن تتمتع إنزيمات اللاكاز باستقرار وأداء جيدين ضمن نطاق واسع من درجات الحرارة.
الاستقرار الحراري (أ) والاستقرار عند درجات حموضة مختلفة (ب) لإنزيم اللاكاز المستخلص من فطر المحار (Pleurotus ostreatus) NRC 620. تم تقييم الاستقرار الحراري بحضانة محلول الإنزيم في محلول منظم من فوسفات الصوديوم بتركيز 0.05 مولار (درجة حموضة 7.0) عند درجات حرارة 40، 50، 60، و70 درجة مئوية لمدة ساعتين. أما الاستقرار عند درجات حموضة مختلفة، فتم تقييمه بحضانة محلول الإنزيم في محلول منظم من سترات الصوديوم بتركيز 0.1 مولار ومحلول منظم من التريس (درجات حموضة 3، 4، 6، و7) عند درجة حرارة 40 درجة مئوية لمدة ساعتين. تم حساب النشاط المتبقي باستخدام ABTS كركيزة بعد الحضانة.
لتحديد الظروف المثلى لاستخدام الإنزيم وتخزينه، درسنا تأثير الرقم الهيدروجيني على استقرار إنزيم اللاكاز. وقد أثر التعرض لقيم مختلفة للرقم الهيدروجيني بشكل ملحوظ على استقرار بنية البروتين، مما أثر بدوره على استقرار جزيء الإنزيم ونشاطه. وأظهرت النتائج أن الإنزيم كان أقل استقرارًا في الظروف الحمضية، بينما أظهر استقرارًا أفضل عند قيم الرقم الهيدروجيني الأعلى (المناطق المتعادلة والقلوية). عند قيم الرقم الهيدروجيني 7.0 و6.0 و4.0 و3.0، كانت معدلات احتفاظ الإنزيم بعد 120 دقيقة تقريبًا 100% و62.54% و52.39% و11.14% على التوالي (الشكل 3ب). وأظهر إنزيم اللاكاز *Strombus multisus* WRF03 استقرارًا أعلى عند قيم الرقم الهيدروجيني المتعادلة (5.5-6.5) واستقرارًا أقل عند قيم الرقم الهيدروجيني الحمضية (أقل من 4.0). بعد 120 دقيقة عند قيم الأس الهيدروجيني 5.5 و 6.0 و 6.5، كانت معدلات الاحتفاظ بالإنزيم تقريبًا 82٪ و 100٪ و 93٪ على التوالي.³³خيرين وآخرون⁴²لوحظ أن اللاكاز من Trametes polyzona WR710-1 كان مستقرًا في نطاق الأس الهيدروجيني من 6.0 إلى 7.0، بينما سيد وآخرون.⁴⁵أظهرت الدراسات أن إنزيم اللاكاز أكثر استقرارًا في ظروف الرقم الهيدروجيني المتعادل. ومع ذلك، أظهر إنزيم اللاكاز المستخلص من نبات سيرينا يونيكولور استقرارًا أيضًا في الظروف القلوية (الرقم الهيدروجيني 9.0).⁴⁶أظهرت إنزيمات اللاكيز المدروسة استقرارًا عاليًا ضمن نطاق واسع من الرقم الهيدروجيني. قد تكون هذه سمة مهمة للتطبيقات الصناعية.
نظراً لأن بعض أيونات المعادن لها تأثيرات محفزة ومثبطة على نشاط الإنزيمات، فإنه يجب مراعاة هذه التأثيرات في التطبيقات الصناعية. وهذا أمر بالغ الأهمية لأن أيونات المعادن من الملوثات البيئية الشائعة التي قد تؤثر على استقرار وتكوين الإنزيمات خارج الخلوية.⁴⁷لتقصّي تأثيرات أيونات المعادن المتعددة على إنزيم اللاكاز المستخلص من فطر المحار (Pleurotus ostreatus) NRC 620، أجرينا تجارب مماثلة. وكما هو موضح في الشكل 4، فإنه اعتمادًا على نوع المعدن المستخدم، أدى رفع تركيز أيون المعدن من 2.5 ملي مولار إلى 10 ملي مولار إلى التأثير سلبًا على وظيفة الإنزيم. على سبيل المثال،^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺، و^Cu²⁺قد يحفز وينشط نشاط الإنزيم، بينما^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺، و^K⁺قد تُثبّط هذه المواد نشاط الإنزيم. عند تركيز 10 ملي مولار، كانت أيونات النحاس (Cu²⁺) والمغنيسيوم (Mg²⁺) أقوى مُنشّطات لنشاط إنزيم اللاكاز المُستخلص من فطر المحار (Pleurotus ostreatus) NRC 620، حيث بلغت نسبة التنشيط حوالي 34% و20% على التوالي. في المقابل، عند تركيز 10 ملي مولار، كانت أيونات الكالسيوم (Ca²⁺) أقوى مُثبّطات لإنزيم اللاكاز، حيث قلّلت من نشاط الإنزيم بنسبة 60% تقريبًا.
تأثير أيونات المعادن على نشاط إنزيم اللاكاز من فطر المحار (Pleurotus ostreatus NRC 620). تم تحضين إنزيم اللاكاز لمدة 10 دقائق في محلول منظم من فوسفات الصوديوم (0.05 مولار، الرقم الهيدروجيني 7.0) يحتوي على أيونات معادن مختلفة بتراكيز 2.5 ملي مولار و10 ملي مولار. ثم تم بدء التفاعل بإضافة الركيزة (ABTS)، وبعد ذلك تم قياس النشاط النسبي.
تتوافق نتائجنا مع نتائج باحثين آخرين وجدوا أن أيونات المغنيسيوم (Mg²⁺) والنحاس (Cu²⁺) تعزز نشاط إنزيم اللاكاز المستخلص من فطر *Trametes polyzona* WRF03³. ووجد كاستانيو وآخرون⁴⁸ أن إنزيم اللاكاز المستخلص من فطر *Xylaria* sp. يُحفز إلى حد ما بواسطة أيونات النحاس (Cu²⁺). علاوة على ذلك، أجرى كل من فوروتانفار وآخرون⁴⁹ وسي وآخرون⁵⁰ دراسات مماثلة على إنزيمات اللاكاز المستخلصة من فطر *Paraconiothyrium variabile* وفطر *Trametes pubescens* على التوالي. ويمكن تشبع موقع ارتباط النحاس من النوع الثاني (T2) لهذا الإنزيم بأيونات النحاس (Cu²⁺) عند تركيز معين، مما قد يفسر تحفيز نشاط اللاكاز عند تركيزات أعلى من أيونات النحاس (Cu²⁺³⁹). بما أن إنزيمات اللاكاز في فطريات العفن الأبيض هي إنزيمات مؤكسدة تحتوي على ذرات نحاس متعددة، فإن تأثيرات أيونات النحاس على نشاط اللاكاز متنوعة وتتراوح بين التحفيز والتثبيط والحياد.⁵¹ في المقابل، ذكر تشو وآخرون^[52]أفاد بأن^Cu²⁺أدى ذلك إلى تثبيط نشاط إنزيم اللاكاز لدى النمل الأبيض الجوفي التايواني (Odontotermes formosanus). ومع ذلك، فإن إنزيمات اللاكاز لدى Cerena sp. HYB07^[53]و Clitocybe maxima^[54]لم تتأثر بأيونات النحاس.
تم تمثيل خصوصية الركيزة من خلال معاييرها الحركية (Km و Vmax)؛ كلما كانت قوة ارتباط الركيزة بالإنزيم أقوى، انخفضت قيمة Km وزادت خصوصية الركيزة.^3,21,55تم تحديد المعاملات الحركية (Km وVmax) لإنزيم اللاكاز من فطر المحار *Pleurotus ostreatus* NRC 620 باستخدام برنامج GraphPad Prism 6.0 عن طريق رسم مخطط Lineweaver-Burk (الشكل 5). عند استخدام ABTS كركيزة، كانت النتائج 1.99 ملي مولار و16217 ميكرومول.^{دقيقة واحدة L⁻¹,}على التوالي. السيد وآخرون.²¹أفادت التقارير أن قيم Km لأكسدة ABTS كانت 0.1 ملي مولار و0.064 ملي مولار على التوالي، مما يشير إلى ألفة عالية للإنزيمين المتماثلين Lac A وLac B تجاه ABTS. علاوة على ذلك، كانت قيم Vmax تساوي 0.182 ميكرومولار.^{دقيقة واحدة}و 0.603 ميكرومول^{دقيقة واحدة}على التوالي. وكانت قيمة Km المُستحصلة أقل من قيمة Trametes polyzona WRF03 (8.66 ملي مولار)؛ علاوة على ذلك، كانت قيمة Vmax الخاصة بها (1429 ملي مول دقيقة⁻¹) أيضًا^أدنىعند استخدام ABTS كركيزة.33 وبالمثل، كانت قيم Km لتركيزات اللاكاز Lentinus squarrosulus MR13 و Trametes sp. AH28-2 هي 0.0714 ملي مولار و 0.025 ملي مولار على التوالي، وكانت قيم Vmax هي 0.0091 ملي مولار دقيقة−1 و 0.67 ملي مولار دقيقة−1 ملغ−1 (مقارنة بـ ABTS).^{على التوالي. 56، 57}
تمت دراسة تأثير تركيز ABTS على نشاط إنزيم اللاكاز المستخلص من فطر المحار *Pleurotus ostreatus* NRC 620، ورُسم مخطط لاينويفر-بيرك الذي يوضح العلاقة بين مقلوب سرعة التفاعل الابتدائية وتركيز ABTS. وقيس تفاعل أكسدة ABTS بتراكيز مختلفة (0.025-3.0 ملي مولار) من اللاكاز عند درجة حموضة 4.5 لتحديد المعاملات الحركية (Vmax وKm). وحُسبت ثوابت ميكايليس-مينتين الحركية باستخدام مخطط لاينويفر-بيرك الذي يوضح العلاقة بين مقلوب سرعة التفاعل وتركيز المادة المتفاعلة. واستُخدم برنامج GraphPad Prism 6.01 لحساب هذه الثوابت الحركية من مخطط لاينويفر-بيرك.
تقوم الإنزيمات التقليدية المستخدمة في التصفية، مثل البكتيناز، بتحليل المواد البكتينية، مما يقلل من اللزوجة والتعكر. وهي تُفكك بفعالية السكريات المتعددة التركيبية، وغالبًا ما تُستخدم مع إنزيمات أخرى، مثل السليولاز والهيميسليولاز، لتحسين الإنتاجية والنقاء. مع ذلك، لا تستهدف البكتيناز المركبات الفينولية تحديدًا، وهي المسببات الرئيسية للتعكر والاسمرار التأكسدي، خاصةً في عصائر مثل عصير التفاح والعنب.⁵⁸على النقيض من ذلك، تحفز إنزيمات اللاكيز أكسدة المركبات الفينولية، مُكَوِّنةً إياها إلى جزيئات أكبر غير قابلة للذوبان، يُمكن إزالتها بالترسيب أو الترشيح. لا تُحسِّن هذه الآلية صفاء العصير فحسب، بل تُطيل أيضًا مدة صلاحيته بتقليل احتمالية اسمراره الناتج عن المركبات الفينولية. علاوة على ذلك، يُمكن إجراء عمليات التصفية القائمة على اللاكيز في ظروف معالجة معتدلة (درجة حموضة 3.5-5.5، درجة حرارة 25-40 درجة مئوية)، مما يجعلها مناسبة للعصائر الرقيقة دون المساس بخصائصها الغذائية أو الحسية.⁵⁹أظهرت الدراسات أن معالجة العصير بالبكتيناز تُصفّيه خلال ساعة إلى ساعتين، بينما تتطلب معالجة اللاكاز عادةً وقتاً أطول (من 3 إلى 6 ساعات) لتقليل المركبات الفينولية بشكل كامل. مع ذلك، يمكن تحسين هذه العملية بتثبيت الإنزيم أو بدمج اللاكاز مع طرق التصفية الميكانيكية.⁶⁰في هذه الدراسة، كشف تحليل الإنزيمات في المستخلص الخام عن نشاط ملحوظ لإنزيمي اللاكاز والألفا-أميليز، بينما كان نشاط إنزيمي البكتيناز والزيلاناز منخفضًا للغاية، ولم يُرصد أي نشاط لإنزيم السليولاز. لذا، يُعزى انخفاض العكارة ومحتوى المركبات الفينولية بشكل رئيسي إلى نشاط إنزيم اللاكاز، في حين أن التغير في اللزوجة قد يُعزى جزئيًا إلى نشاط إنزيم الأميليز.
يُبين الجدول 1 الخصائص الفيزيائية والكيميائية لعصير التفاح الطازج والعينات المعالجة بإنزيم اللاكاز. وأظهرت النتائج أن نسبة إنتاج عصير التفاح الطازج (71.59%) كانت أقل من نسبة إنتاج العينات المعالجة بإنزيم اللاكاز (87.34%). وتتفق هذه النتائج مع نتائج دراسة بيلنيك وأورانج.⁶¹أشار الباحثون إلى أن استخدام الإنزيمات في معالجة الفاكهة يمكن أن يزيد من إنتاجية العصير، ويُحسّن عملية الترشيح، ويُنتج عصيرًا عالي الجودة ونقيًا للتركيز. ويعود السبب الرئيسي لزيادة إنتاجية العصير إلى ارتفاع محتوى السكريات الذائبة فيه. فخلال عملية التحلل الإنزيمي للفاكهة، تتحلل الميزوجليا والبكتين الموجودتان في جدران خلايا المنتج، وتتحولان إلى مواد ذائبة مثل السكريات والأحماض.^62.كانت قيمة الرقم الهيدروجيني لعصير التفاح المعالج بالإنزيم أقل بكثير من قيمة الرقم الهيدروجيني لمجموعة المقارنة (P < 0.05)، وارتفعت قيمة الرقم الهيدروجيني لكلا المجموعتين بشكل ملحوظ أثناء التخزين (الجدول 1). تتوافق هذه النتائج مع نتائج مارك وآخرون.⁶³لاحظ الباحثون انخفاض درجة حموضة عصير الكاجو بعد تخزينه عقب المعالجة الحرارية. وقد يكون تحلل البكتين وتكوّن حمض الجالاكتيورونيك بعد المعالجة الإنزيمية مسؤولاً عن ارتفاع درجة الحموضة أثناء التخزين. وتراوحت درجة حموضة العينات المعالجة بالإنزيم بين 4.05 و4.31 طوال فترة التخزين، بينما تراوحت درجة حموضة عصير التفاح غير المعالج بين 4.12 و4.33.
أظهرت الحموضة الكلية (TA) لكل من العينات غير المعالجة والمعالجة باللاكاز اتجاهًا تنازليًا مع زيادة مدة التخزين (الجدول 1). ويعزى انخفاض الحموضة إلى تحول الأحماض العضوية إلى كربوهيدرات أو تفاعلات إنزيمية، بالإضافة إلى الأكسدة أثناء تخزين العصير.⁶⁴كانت الحموضة الكلية لعصير التفاح غير المعالج والعينات المعالجة بالإنزيم أقل من حموضة العصائر الأخرى (عصير الفراولة 0.9%، عصير البرقوق 2.2%، عصير الكُمكوات 1.0%، عصير المشمش 2.4%، عصير البرتقال 0.8%)، ولكنها مماثلة لحموضة العصائر الأخرى (مثل عصير الكمثرى 0.3%).⁶²قد تعود هذه الاختلافات في عصير التفاح الطازج غير المعالج إلى عوامل مختلفة مثل ظروف النمو، والعوامل الوراثية، ومستوى النضج، وطرق المعالجة.⁶⁵يتوافق انخفاض الحموضة الكلية لعصير التفاح المعالج باللاكاز وعصير التفاح غير المعالج مع النتائج التي قدمها سينغ وآخرون.⁶⁶فيما يتعلق بانخفاض الحموضة الكلية لعصير تفاح جين نو بعد 74 يومًا من التخزين. من ناحية أخرى، أوشميانسكي ووجديلو⁶⁷لم يتم العثور على أي تغييرات كبيرة في حموضة عصير التفاح عند دراسة تأثير طرق التصفية التقليدية.
تشير النتائج الموضحة في الجدول 1 إلى أن قيمة إجمالي المواد الصلبة الذائبة (TSS) في عصير التفاح المعالج باللاكاز كانت أعلى من قيمتها في العينة غير المعالجة. وتتفق هذه النتائج مع الدراسات المنشورة.⁶⁸علاوة على ذلك، يُظهر الجدول 1 أن قيمة إجمالي المواد الصلبة الذائبة (TSS) لمجموعة عصير التفاح الضابطة كانت 9.58 عند نقطة البداية ووصلت إلى 11.05 بنهاية فترة التخزين. هذه القيم أقل من قيم إجمالي المواد الصلبة الذائبة لعصير التفاح الطازج التي أوردها حامد وآخرون.⁶⁹(11.2 و11.80 على التوالي). ارتفعت قيمة المواد الصلبة الذائبة الكلية (TSS) في عينات عصير التفاح المعالج باللاكاز بشكل ملحوظ، بدءًا من 11.23 ووصولًا إلى 12.93 بعد أسبوعين من التخزين عند 4 درجات مئوية (الجدول 1). لوحظ ارتفاع مماثل في قيمة TSS أثناء التخزين في الحمضيات والليمون والبرتقال الحلو. قد يعود ارتفاع قيمة TSS أثناء التخزين إلى تحلل السكريات المتعددة (النشا) إلى سكريات أحادية (سكريات)، وزيادة التركيز نتيجة لجفاف العصير، وتحلل البكتين في العصير إلى مواد صلبة ذائبة. من المرجح أن يكون ارتفاع قيمة TSS ناتجًا عن زيادة السكريات الذائبة، والتي قد تتكون من تحويل البكتين أو السليلوز إلى سكريات ذائبة بواسطة إنزيم البكتين أو السليولاز على التوالي، أو من تحلل النشا إلى سكريات، كما ذكر حامد وآخرون.^69.يمكن ملاحظة تأثير إنزيم اللاكاز على خصائص عصير التفاح بصريًا، حيث يتميز العصير المعالج باللاكاز بانسيابية أفضل ولزوجة أقل من العصير غير المعالج. وقد سُجلت هذه الملاحظة في الجدول 1؛ إذ بلغت لزوجة العينة المعالجة بالإنزيم 1.87 سنتي بواز، بينما بلغت لزوجة عينة المقارنة 2.95 سنتي بواز. يُعزى هذا الانخفاض الملحوظ في اللزوجة على الأرجح إلى زيادة قدرة المواد الشبيهة بالبكتين على الاحتفاظ بالماء، وتكوين بنية شبكية متماسكة.
في هذه الدراسة، تمّ التحقق من تأثير إنزيم اللاكاز على مؤشر التسمير (BI) لعصير التفاح عن طريق قياس الامتصاص عند 420 نانومتر باستخدام مطياف ضوئي. تُظهر النتائج في الجدول 1. خلال التخزين، أظهر مؤشر التسمير لعينات عصير التفاح في كلتا المجموعتين، المعالجة وغير المعالجة، اتجاهًا تصاعديًا تدريجيًا. يعكس مؤشر التسمير درجة التسمير ويمكن استخدامه كـ^{أمر مهم}مؤشر على تفاعلات التسمير الإنزيمية وغير الإنزيمية. ازداد الامتصاص بشكل ملحوظ أثناء التخزين (P < 0.05). في نهاية فترة التخزين،_A420ارتفعت قيمة عينات عصير التفاح في مجموعتي التحكم والمعالجة بالإنزيم بنسبة 217% و121% تقريبًا على التوالي (الجدول 1). تشير النتائج إلى أن المعالجة بالإنزيم تُقلل بشكل فعال من درجة الاسمرار بنسبة 56% تقريبًا. وتتفق هذه النتائج مع نتائج بيزيرا وآخرون.^[19] تتوافق مع نتائجنا؛ فقد استخدموا ألياف جوز الهند والغلوتارالدهيد واللاكاز لتصفية عصير التفاح، مما أدى إلى تقليل لونه الأصلي بنسبة 61٪.
على الرغم من أن البوليفينولات الموجودة في عصائر الفاكهة لها آثار غذائية وعلاجية إيجابية على جسم الإنسان، إلا أنها يمكن أن تتفاعل أيضًا مع البروتينات، مما يتسبب في تعكر العصير أو ترسبه أو تعكره، وبالتالي تغيير نكهة ورائحة المنتج وتقليل مدة صلاحيته.⁷¹هدفت هذه الدراسة إلى خفض محتوى المركبات الفينولية في عصير التفاح بطريقة آمنة باستخدام إنزيم اللاكاز المستخلص من فطر المحار (Pleurotus ostreatus NRC 620). تُظهر النتائج الموضحة في الجدول 1 انخفاضًا ملحوظًا في إجمالي محتوى المركبات الفينولية في عصير التفاح المعالج باللاكاز قبل التخزين عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. علاوة على ذلك، انخفض إجمالي محتوى المركبات الفينولية أيضًا أثناء التخزين في كلتا العينتين المدروسة (الجدول 1). (بحث ساندري وآخرون).⁷²أظهرت الدراسات أن عصير التفاح المعالج بالإنزيمات يمكنه الاحتفاظ بنشاطه المضاد للأكسدة ومحتواه من المركبات الفينولية. ومع ذلك، فإن نتائج دراسة أجراها ليتيرا وآخرون...⁷³أظهرت الدراسات أن معالجة عصير البرتقال باستخدام إنزيم اللاكاز الفطري يمكن أن يقلل من محتوى المركبات الفينولية فيه بنسبة تصل إلى 45٪.
لقد ثبت أن للمركبات الفينولية خصائص مثل التخلص من الجذور الحرة، واختزال وإخماد الأكسجين الأحادي، ونقل ذرة الهيدروجين، والتبرع بالإلكترونات للجذور الحرة، مما يجعلها مضادات أكسدة قوية.⁷⁴لذا، في هذه الدراسة، استُخدمت طريقتان تعتمدان على DPPH وFRAP لتقييم تأثير إنزيم اللاكاز على النشاط المضاد للأكسدة لعصير التفاح المخزن في الثلاجة لمدة 14 يومًا (الجدول 2). أظهرت كلتا الطريقتين زيادة في النشاط المضاد للأكسدة أثناء التخزين، وهو ما قد يُعزى إلى زيادة المركبات الفينولية الحرة أو تكوّن نواتج تفاعل ميلارد (MRPs)، حيث يُرجّح أن تكون نواتج تفاعل ميلارد هي السبب في زيادة النشاط المضاد للأكسدة.⁷⁵تُنتج تفاعلات التسمير غير الإنزيمية (بما في ذلك تحلل حمض الأسكوربيك، وتفاعلات ميلارد، والتحلل المحفز بالأحماض للسكريات) أصباغًا بنية اللون (الميلانويدينات). ويمكن أن تتفاعل نواتج تحلل حمض الأسكوربيك الوسيطة ونواتج تحلل السكريات (مثل مركبات الكربونيل) مع الأحماض الأمينية من خلال تفاعلات ميلارد.⁷⁶على الرغم من أن اسمرار الفواكه والخضروات أثناء التخزين قد تمت دراسته على نطاق واسع، إلا أن فهمنا لهذه التفاعلات لا يزال محدودًا.⁷⁷بالمقارنة مع طريقة FRAP، أظهر عصير التفاح المعالج باللاكاز نشاطًا مضادًا للأكسدة أقل بكثير باستخدام طريقة DPPH (الجدول 2)، كما ازداد النشاط المضاد للأكسدة لجميع العينات بشكل ملحوظ مع زيادة مدة التخزين. استُخدمت طريقتان مختلفتان لتحديد النشاط المضاد للأكسدة في هذه الدراسة نظرًا لاختلاف مبادئهما. تقيس طريقة DPPH القدرة على معادلة الجذور الحرة، بينما تقيس طريقة FRAP القدرة على اختزال أيونات الحديد. لذا، يُوصى باستخدام طرق متعددة لتحديد النشاط المضاد للأكسدة لفهم أفضل لنشاط مضادات الأكسدة في العينات المدروسة.⁷⁸
من أهم نتائج هذه الدراسة أن إنزيم اللاكاز NRC 620 المستخلص من فطر المحار (Pleurotus ostreatus) يُظهر نشاطًا مثاليًا عند درجة حرارة 70 درجة مئوية ودرجة حموضة 3.0. وبالمقارنة مع أنواع اللاكاز الفطرية الأخرى الشائعة الاستخدام في تصفية العصائر، مثل لاكاز Trametes versicolor و Ganoderma lucidum، يتميز لاكاز P. ostreatus NRC 620 بثبات حراري أعلى ودرجة حموضة أكثر حمضية. عادةً ما يُظهر لاكاز Trametes versicolor و Ganoderma lucidum نشاطًا مثاليًا في نطاق 50-60 درجة مئوية وقيم حموضة تتراوح بين 3.5 و 5.0. قد يُساهم هذا الاختلاف في تحسين كفاءة تصفية العصائر، خاصةً للعصائر الحمضية حيث يُعد الثبات عند قيم حموضة منخفضة أمرًا بالغ الأهمية. تُعد الخاصية الفريدة لـ P. بالمقارنة مع أنواع اللاكيز الفطرية الأخرى التي دُرست، يُظهر فطر المحار *Pleurotus ostreatus* NRC 620 قدرةً على العمل بكفاءة في ظروف أكثر صعوبة. تشير درجة حرارة نشاطه المثلى الأعلى إلى مزايا محتملة في التطبيقات الصناعية، مثل سرعة التفاعل وتقليل التلوث الميكروبي. قد يكون انخفاض درجة حموضته، الملائم لطبيعة العديد من العصائر الحمضية، مفيدًا في عمليات تصفية العصائر. تُبرر هذه النتائج إجراء المزيد من الأبحاث لتطبيقه على نطاق واسع، مما يجعل *Pleurotus ostreatus* NRC 620 بديلاً قابلاً للتطبيق لمصادر اللاكيز الفطرية التقليدية. بالمقارنة مع الدراسات السابقة، وجدنا أن درجة الحرارة المثلى هي 60 درجة مئوية، ودرجة الحموضة المثلى هي 3.0. بعد التفاعل عند 60 درجة مئوية لمدة 80 دقيقة، احتفظ لاكيز *Ganoderma lucidum* بـ⁴⁶0.79% من نشاطها، وفقًا لكورنياواتي ونيسيل.⁸⁰تُظهر إنزيمات فطر *Ganoderma lucidum* استقرارًا ممتازًا إلى متوسط ​​عند درجة حرارة 25 درجة مئوية وقيم أس هيدروجيني تتراوح بين 5.0 و8.0، واستقرارًا عند أس هيدروجيني 6.0 ودرجات حرارة تتراوح بين 10 و30 درجة مئوية. في هذه الدراسة، وجدنا أن الأس الهيدروجيني الأمثل ودرجة الحرارة المثلى لنشاط إنزيم *Pleurotus ostreatus* هما 3.0 و70 درجة مئوية على التوالي. بعد حضانة الإنزيم عند 40 درجة مئوية و50 درجة مئوية لمدة ساعتين، احتفظ الإنزيم بنسبة 68.33% و59.61% من نشاطه على التوالي. علاوة على ذلك، أظهر إنزيم لاكاز Pleurotus ostreatus NRC 620 نشاطًا عاليًا على نطاق واسع من درجات الحرارة من 50 درجة مئوية إلى 80 درجة مئوية، حيث اقترب من الحد الأقصى للنشاط (69%–98%)، مع ملاحظة أعلى نشاط عند 70 درجة مئوية.
في الختام، أظهر إنزيم لاكاز NRC620 المستخلص من فطر المحار في ظروف ثابتة، نشاطًا واستقرارًا مثاليين عبر نطاق واسع من درجات الحموضة والحرارة، مما يدل على استقرار فائق مقارنةً بمصادر الإنزيم الأخرى. وقد أدت إضافة 10 ملي مول من كبريتات المغنيسيوم وكبريتات النحاس إلى زيادة نشاط الإنزيم بنسبة 21% و35% تقريبًا على التوالي. وعند معالجته في عصير التفاح، خفّض الإنزيم درجة الحموضة واللزوجة، بينما انخفض محتوى المركبات الفينولية انخفاضًا طفيفًا فقط أثناء التخزين.
تؤكد النتائج إمكانات إنزيم اللاكيز في صناعة الأغذية، ولا سيما في تصفية المشروبات. فمن خلال تحليله للمركبات الفينولية، لا يقلل اللاكيز من العكارة ويحسن صفاء المشروبات فحسب، بل يحافظ أيضًا على جودة عصائر الفاكهة في ظل ظروف تشغيل معتدلة. وعلى عكس عوامل التصفية التقليدية كالجيلاتين والبنتونيت وهلام السيليكا، لا يُنتج اللاكيز أي نفايات ولا يُزيل النكهات الزكية من المشروبات، مما يجعله خيارًا أكثر ملاءمة للبيئة واستدامة. علاوة على ذلك، وبالمقارنة مع الإنزيمات الأخرى وطرق الترشيح، يُقدم اللاكيز حلاً فعالاً من حيث التكلفة ومناسبًا دون المساس بجودة المنتج.
كيوموهيمبو، إتش دي وبرينك، إتش جي. تطبيقات واستراتيجيات تثبيت اللاكيز المحتوية على النحاس؛ مراجعة. هيليون 9، e13156 (2023).